Nanomaterialien in Medizinprodukten – Verhalten in biologischen Systemen, Tests und deren Fallstricke

Anfang des Jahres haben wir Ihnen bereits einen kompakten Überblick zu Nanomaterialien und deren Anwendung in Medizinprodukten gegeben. Dabei wurden Ihnen die regulatorischen Anforderungen der Verordnung (EU) 2017/745 (MDR) und der Biokompatibilität nach ISO 10993-1 nähergebracht. Darauf aufbauend geht es in dieser Fortsetzung um die Besonderheiten in Bezug auf Nanomaterialien und deren Verhalten in biologischen Systemen. Diese Besonderheiten gilt es zu beachten, um geeignete Tests, passend zur Anwendung der Medizinprodukte, zu planen sowie Fallstricke von Beginn an zu kennen und zu berücksichtigen. Nur so können Nanomaterialien korrekt und sinnvoll getestet und anschließend bewertet werden, um die Sicherheit Ihrer Medizinprodukte gewährleisten zu können.

Nanomaterialien – verschiedene Definitionen

Um den Wiedereinstieg in das Thema zu erleichtern, werden hier nochmals gängige Definitionen von Nanomaterialien erläutert:

Gemäß der Empfehlung der EU-Kommission 2011/696/EU werden Nanomaterialien als

• natürliches, bei Prozessen anfallendes oder hergestelltes Material, das aus festen Partikeln besteht, verstanden. Diese treten entweder eigenständig oder als erkennbare konstituierende Partikel in Aggregaten oder Agglomeraten auf. Mindestens 50 % dieser Partikel erfüllen in der Anzahlgrößenverteilung wenigstens eine der folgenden Bedingungen:
• ein oder mehrere Außenmaße der Partikel liegen im Größenbereich von 1 nm bis 100 nm;
• die Partikel haben eine längliche Form wie z. B. Stab, Faser oder Röhre, wobei zwei Außenmaße kleiner als 1 nm sind und das andere Außenmaß größer als 100 nm ist;
• die Partikel haben eine plättchenartige Form, wobei ein Außenmaß kleiner als 1 nm ist und die anderen Außenmaße größer als 100 nm sind.

Diese Definition wurde auch in der MDR aufgenommen und genauer definiert: unter dem Begriff "Nanomaterial" werden natürliche Materialien, zufällig vorhandene Partikel oder eigens hergestellte Nanomaterialien verstanden.

Die wunderbare Welt der Nanomaterialien

Wie schon aus den oben aufgezeigten Definitionen hervorgeht, gibt es nicht nur "das eine Nanomaterial", sondern viele verschiedene Variationen. Diese können sich in

• der Oberflächenchemie,
• ihrer Komposition,
• ihren physikalischen Eigenschaften und
• ihren möglichen Zielliganden

unterscheiden.

Diese vier groben Unterscheidungen bringen ebenfalls eine Vielzahl an Möglichkeiten mit, die im Folgenden an drei Beispielen verdeutlicht werden.

Beispiel 1: Die Oberflächenchemie kann sich in

• der Oberflächenladung,
• der Oberflächenfunktionalität, durch anhängen gewisser Reste wie z. B. -NH2, -OCH3 oder -COOH, bzw.
• der Hydrophobie, Hydrophilie, Lipophobie oder Lipophilie

unterscheiden.

Beispiel 2: Die Komposition der Nanomaterialien ist ebenfalls sehr vielseitig und reicht von

• Nanoshells (Nanohüllen/-schalen) = kugelförmiger Nanopartikel, aus einem dielektrischen Kern, der von einer dünnen metallischen Hülle bedeckt ist,
• Silica / Siliziumdioxid; Eisenoxid,
• Quantum dots (Quantenpunkte),
• Polymerpartikeln und
• metallische Nanopartikel bis hin zu
• Liposomen,
• Mizellen und
• Dendrimeren.

Neben ihrer physischen Erscheinungsform, die Dreiecke, Stäbchen, Würfel oder Kugeln annehmen können, können sich Nanomaterialien auch in ihren mechanischen Eigenschaften unterscheiden. Hierbei ist insbesondere die Porosität, die Oberflächenrauheit und die Festigkeit/Steifigkeit zu berücksichtigen.

Beispiel 3: Zu guter Letzt können Nanomaterialien auch mit spezifischen Zielliganden gekoppelt sein. Zielliganden können dabei je nach Anwendungsintention variieren. Dabei finden

• Polymere,
• kleine Moleküle,
• Nukleinsäuren,
• Proteine / Peptide oder
• Antikörper

ihren Einsatz, um z. B. im Fall von Proteinen an den richtigen Zielorganen anzukommen.

Bei der Synthese von Nanomaterialien sind die Möglichkeiten nahezu unbegrenzt. Gerade deswegen sollte sich, wenn der Einsatz in oder als Medizinprodukt vorgesehen ist genau überlegt werden, welche Materialien zum Einsatz kommen.

Verhalten von Nanomaterialien in biologischen Systemen

Wie zuvor verdeutlicht wurde, gibt es unzählige Möglichkeiten Nanomaterialien zu gestalten. Jede Variation kann sich je nach Umgebung anders verhalten. So kann z. B. ein Protein oder kleine Moleküle sich im Reagenzglas bzw. im Testansatz, also in vitro, erwartungsgemäß verhalten. Beim anschließenden in vivo-Test kann dann die Ernüchterung kommen, dass die Intention nicht mehr gegeben ist. Woran liegt das?

Generell gibt es bei Nanomaterialien bzw. Nanopartikeln besondere Fragestellungen, da Nanopartikel eine große Oberfläche haben und so potenziell eine höhere chemische Reaktivität denkbar ist. Des Weiteren stellt sich die Frage, ob mit der geringen Größe sonst gut funktionierende Barrieren wie die Haut oder das Lungenepithel überwunden werden können, vor allem wenn dieser Übertritt nicht geplant ist.

Bei Nanomaterialien wird generell zwischen der synthetischen Identität und der biologischen Identität unterschieden. Wie der Name bereits vermuten lässt, ist unter der synthetischen Identität der Zustand zu verstehen, den das Nanomaterial direkt nach Synthese innehat. Hier sollte das Material alle vorgesehenen Eigenschaften besitzen und so agieren, wie es vorgesehen ist. Dies ändert sich bereits bei dem ersten Kontakt am vorgesehenen Einsatzort, da hier erste Wechselwirkungen mit der Umgebung stattfinden. Solche Wechselwirkungen äußern sich in der Bindung mit Biomolekülen z. B. Proteinen oder Lipiden. Diese erste Schicht, welche "harte Corona" (engl. hard corona) genannt wird, bildet sich innerhalb von Sekunden und löst sich nur schwer. Ebenso ändert sich die Zusammensetzung so gut wie nicht mehr nach initialer Ausbildung. Zusätzlich dazu bildet sich auch innerhalb weniger Minuten bis Stunden eine "weiche Corona" (engl. soft corona), deren Zusammensetzung eher agil ist. Die Ausbildung der Proteincorona lässt sich ohne Oberflächenmodifikation nicht verhindern. Es gibt zudem Modifikationen, die die Ausbildung verringern.

Durch die Ausbildung der Proteincorona bekommt der Nanopartikel seine biologische Identität und hat nun, abweichend von seiner synthetischen Identität, ein anderes Verhalten und vor allem ein anderes pharmakologisches/biokinetisches Profil.

Ein weiterer Punkt der bedacht werden sollte, ist das Vorliegen des Nanopartikels. Dieser kann als Einzelpartikel oder Agglomerat, abhängig von seiner Umgebung auftreten. Das Vorliegen kann auch hier einen Einfluss auf physikochemische, biologische und pathobiologische Eigenschaften des Materials haben.

Es ist von größter Relevanz sich zu Beginn mit der vorgesehenen Anwendung des Nanomaterials und welche Biokinetik potenziell vorliegen kann zu beschäftigen. Gemäß ISO 10993-1 muss das Medizinprodukt nach Art des Körperkontakts eingeteilt werden. Bereits hier muss genau darauf geachtet werden welcher Kontakt vorliegt: ein Nanomaterial, das nur Kontakt mit intakter Haut hat kann bereits bei Kontakt mit Schleimhaut eine ganz andere Kinetik aufweisen. Zusätzlich muss die Kontaktdauer und der Expositionsweg genau bedacht bzw. charakterisiert werden. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass Sie auch bei Nanomaterialien gemäß ISO 10993-1 relevante, bereits vorhandene Informationen spezifisch für Ihr Nanomaterial einholen. Sollte sich hier herausstellen, dass eine ausreichende Datenlage bereits vorhanden ist und die zuvor identifizierten Risiken als akzeptabel eingestuft werden können, so müssen laut ISO 14971 und ISO 10993-1 keine weiteren Tests erfolgen. Jedoch muss dafür die Äquivalenz des Nanomaterials zu den vorliegenden Daten aufgezeigt werden. Nähere Informationen dazu finden Sie im Kapitel 4.4 der ISO/TR 10993-22 . Dadurch, dass Nanomaterialien bisher nur wenig erforscht sind, werden meist weitere Tests zur Charakterisierung und anschließende Toxizität- bzw. Biokompatibilitätstests notwendig.

Charakterisierung von Nanomaterialien

Eine gründliche Charakterisierung der vorgesehenen Nanomaterialien ist unabdinglich. Dabei muss die Charakterisierung bezüglich der synthetischen und der biologischen Identität, inklusive aller weiteren relevanten Einflüsse, z. B. Reinigungs- und Sterilisationsverfahren erfolgen. Nur so kann eine adäquate Bewertung stattfinden, welche die Voraussetzung für valide Toxizitätsaussagen und dementsprechend auch für den Nachweis der Biokompatibilität ist. Wie aus den vorherigen Abschnitten hervorgeht, sind Nanomaterialien wesentlich anspruchsvoller als konventionelle Werkstoffe wie z. B. Titan. Deshalb sollte direkt bei der Neuentwicklung eine ausführliche Charakterisierung am finalen Medizinprodukt, also wie es im Patienten angewandt wird, durchgeführt werden. Innerhalb der ISO/TR 10993-22, Kapitel 5 werden unter anderem folgende Dinge betrachtet:

• chemische Zusammensetzung,
• Morphologie,
• Größenverteilung,
• Oberflächenladung,
• Kurz- und Langzeitstabilität und
• Bildgebung.

Diese Eigenschaften sind als Startpunkt anzusehen und reichen lange nicht aus, um eine ausreichende Bewertung durchzuführen. Nanomaterialien müssen genauso wie konventionelle Medizinprodukte in der Form getestet werden, wie diese letztendlich im Patienten angewendet werden.

Auch Nanomaterialien, die sich durch Abnutzung/Verschleiß des Medizinproduktes bilden, sollten isoliert und charakterisiert werden, was meist eine Herausforderung darstellt. Dabei sollten Sie sich genau überlegen welche Tests die in situ-Situation der klinischen Anwendung darstellen, diese dementsprechend auswählen und begründen.

Weitere Charakteristika , die besonders im Hinblick auf die zelluläre Interaktion betrachtet werden sollten, sind:

• Oberflächenarchitektur
• Oberflächenrauheit,
• gesamte Oberfläche sowie
• bei inkorporierten Nanomaterialien – Anzahl der Erhebungen an der Oberfläche;
• bei Porosität
• Größe, Struktur und Verteilung der Poren bzw. Hohlräumen sowie
• Dichte des Materials;
• Geometrie der Produkte und das dadurch bestimmte mechanische Verhalten der Materialien.

Zur besseren Bewertung sollten, wie bei allen Tests die Referenzmaterialien mitgetestet werden. Aktuell sind keine Standard-Referenzmaterialien benannt. Dennoch sind Referenzmaterialien für die Bewertung der Partikelgröße von Nanomaterialien in zunehmendem Maße von nationalen und gemeinschaftlichen Einrichtungen erhältlich, darunter das "National Institute of Standards and Technology" (NIST, Vereinigte Staaten), die "Gemeinsame Forschungsstelle der Europäischen Kommission" (GFS, Europäische Union) und die Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung (BAM, Deutschland). Die BAM unterhält in Zusammenarbeit mit ISO/TC 229 die Datenbank "Nanoscaled Reference Materials Home" mit allen derzeit verfügbaren nanoskaligen Referenzmaterialien.

Unabhängig davon welches Nanomaterial Sie verwenden und welche Referenzmaterialien passend sind, sollten Sie eine detailreiche Charakterisierung und Dokumentation sicherstellen. Dabei ist es besonders wichtig alle Aspekte wie

• Identität,
• Lagerung und
• Stabilität

der Nanomaterialien zu dokumentieren. Relevant ist zudem, welche Charakteristika die verwendeten Testmedien oder Messlösungen besitzen. Folgende Punkte sollten dabei dokumentiert und berücksichtigt werden

• Ionenstärke,
• Konzentration der in Lösung präsenten Ionen,
• pH-Wert inklusive pH Puffersystemidentifikation,
• organische Additive wie z. B. Serum oder Antibiotika und
• Identität und Konzentration von Dispergenzien – falls verwendet.

Alle genannten Punkte fließen am Ende, spezifisch für das vorliegende Produkt und der vorgesehenen Anwendung, in die Erstellung eines potenziellen Verhaltensprofils ein, welches zum Eruieren der zu testenden Endpunkte verwendet werden kann.

Designanforderungen – nanotoxikologische Untersuchungen

Neben den bisher vorgestellten Charakterisierungen spielen nanotoxikologische Untersuchungen eine nicht weniger wichtige Rolle. Deshalb müssen toxikokinetische Studien im Rahmen der toxikologischen Risikobewertung von Medizinprodukten, die Nanomaterialien enthalten, berücksichtigt werden. Wichtig ist dabei, zu wissen, ob die eingesetzten Nanomaterialien überhaupt das Potenzial haben, aufgenommen, verteilt, metabolisiert und/oder ausgeschieden werden zu können. Nachdem Sie die relevanten Erkenntnisse gewonnen oder sogar Untersuchungen gemäß ISO 10993-16 durchgeführt haben, folgt auf Basis derer ggf. eine toxikologische Risikobewertung im Rahmen des Risikomanagements. Diese ist aufgrund der speziellen Eigenschaften der Nanomaterialien besonders herausfordernd, weshalb Sie folgende Anforderungen bei der Testung beachten sollten:

• Kontrolle der Partikeleigenschaften unter den verschiedenen Versuchsbedingungen.
• Verwendung der korrekten Methoden und des Studiendesigns.
• Vorgehen nach etablierten Methoden (EU NanoSafety Cluster – The NanoSafety Community) und erstellten SOPs (= Standard Operating Procedures; Nanommune, Quality Handbook, Standard Procedures for Nanopaticle Testing; Stand: 2011), die innerhalb von EU-Forschungsprojekten erstellt wurden.
• Verwendung der korrekten Dosis, um korrekte Dosis-Wirkungs-Beziehungen ableiten zu können
• ACHTUNG: Überdosierung des Materials.
• Verwendung eines geeigneten biologischen Modells.
• Mitführen von geeigneten Positiv- und Negativ-Kontrollen.
• Einsatz von Referenzmaterialien.

Unter Beachtung dieser Anforderungen haben Sie die Möglichkeit reproduzierbare und verifizierbare Ergebnisse zu erzielen, um darauf aufbauend eine aussagekräftige toxikologische Risikobewertung erstellen zu können.

Das nachfolgende Beispiel der Kontrolle der Partikeleigenschaften unter den verschiedenen Versuchsbedingungen verdeutlicht dies: Wenn sich aus den Versuchen bereits ableiten lässt, dass Ihre Nanomaterialien sich unter den Versuchsbedingungen in sehr stabile Aggregate oder Agglomerate gruppieren, dann wären alle weiteren Ergebnisse nicht mehr auf die Nanoskalierung zurückzuführen, sondern auf andere Einflüsse.

Die potenziell zu betrachtenden Endpunkte werden auch ab Kapitel 9.2 des ISO/TR 10993-22 erläutert.

Fallstricke innerhalb der Tests

Neben den oben aufgezeigten Punkten gibt es noch weitere Fallstricke, die einem innerhalb der jeweiligen Tests auf die Füße fallen können. Wir stellen Ihnen zwei Beispiele vor.

In vitro Zytotoxizität
Im Rahmen dieser Testung werden häufig kolorimetrische oder fluoreszente Messverfahren eingesetzt, um z. B. die Zell-Viabilität zu messen. Dabei können Nanopartikel aufgrund ihrer elektrischen Ladungen und optischen Eigenschaften zu Interferenzen führen, wie z. B. Adsorption der Farbstoffe an den Nanomaterialien und somit die fehlende Metabolisierung der Farbstoffe. Weiterhin können Nanopartikel Interaktionen mit im Medium vorhandenen Nährstoffen eingehen. All dies kann unter Umständen zu verfälschten bis falsch positiven Ergebnissen führen. Hier gilt, dass vor der Testung ein geeignetes Testsystem gefunden werden muss, unter Berücksichtigung der vorhandenen Charakterisierung. Nur so können relevante Ergebnisse generiert werden.

Genotoxizität, Karzinogenität und Reproduktionstoxizität
Nanomaterialien können aufgrund ihrer Eigenschaften auch mutagen oder klastogen wirken, da sie an Orte in der Zelle gelangen können und dort entweder direkt auf die DNA oder indirekt z. B. über Induktion von reaktiven Sauerstoffspezies wirken können. Bevor mit dem gängigsten Test auf bakterielle Rückmutation (Ames Test) gestartet werden kann, sollten Sie sich die Frage stellen "Kann der Test mir das gewünschte Ergebnis liefern?". Im Falle des Ames Test kommt es oft zu dem Problem, nicht genau zu wissen, ob die Nanomaterialien überhaupt an den Wirkungsort, also in die Bakterienzelle, gelangen, um dadurch auf die DNA wirken zu können. Zusätzlich müssen Sie auf häufig eingesetzte Additive (z. B. S9-Mix, um die Metabolisierung in der Leber nachzustellen) achten und kritisch hinterfragen "Kann mein Material überhaupt über die Leber metabolisiert werden?". Des Weiteren können sich im Medium vorkommende Proteine an die Nanomaterialien binden und so die Aufnahme und Reaktivität innerhalb des Versuchsansatzes beeinflussen.

Bevor Sie an in vivo-Versuche denken, müssen Sie erst nachweisen, dass das Nanomaterial überhaupt an die relevanten Organe gelangt.

Dies sind nur zwei Beispiele für Fallstricke, die Ihnen bei Tests von Nanomaterialien begegnen können. Wie eingangs erwähnt, ist eine gründlich durchdachte Planung zwingend erforderlich, um relevante Ergebnisse zu erhalten.

Fazit

Nach alldem, was Sie nun über Nanomaterialien erfahren haben, könnte der Eindruck entstanden sein, dass es nicht sinnvoll ist deren Einsatz innerhalb von Medizinprodukten absichtlich zu forcieren. Dennoch lohnt es sich eine Lanze für diese besonderen Materialien zu brechen, da sie neben ihren speziellen Eigenschaften oder gerade deswegen eine ungemein bedeutende Rolle innehaben. Dies gilt in Teilen bereits auch für die Medizintechnikindustrie und wird in der Zukunft sicherlich noch weiter an Relevanz gewinnen. Es ist ein gewisser Aufwand damit verbunden, alle Dinge ausreichend und sinnvoll in Erfahrung zu bringen. Das ist uns klar, allerdings fördert dies neben der Sicherheit Ihrer Medizinprodukte auch weitere Innovationen, die von großem Nutzen sein können.

Stehen Sie gerade vor der Herausforderung, Ihr Medizinprodukt im Hinblick auf Nanomaterialien zu charakterisieren und zu bewerten? Bestehen dabei Unklarheiten wie Sie sinnvoll vorgehen sollen? Oder sind Sie generell dabei, eine geeignete Prüfstrategie zur toxikologischen Risikoabschätzung und Biokompatibilität Ihrer Medizinprodukte zu entwickeln? Unsere Fachexpert*innen unterstützen Sie gerne und entwickeln gemeinsam mit Ihnen individuelle Lösungen für Ihre Fragestellungen. Wir freuen uns auf Ihre Kontaktaufnahme für ein unverbindliches und kostenfreies Erstgespräch.

Beste Grüße
Dr. Carolin Schilpp

Dr. Carolin Schilpp

Biological Safety Expert    Regulatory Affairs & Technical Documentation

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